Od drugiej połowy XVII wieku rozpoczął się stopniowy upadek Akademii Zamojskiej. Po śmierci kanclerza Akademia zaczęła jednak powoli tracić na znaczeniu. W 1699 roku próbę jej zreformowania, podjętą przez biskupa chełmskiego M. Święcickiego, udaremnił opór profesorów i członków kapituły kolegiackiej. Plany reformy ordynata Tadeusza Zamojskiego – syna założyciela Akademii, w 1745 roku nie zostały zrealizowane z powodu braku funduszy. W 1746 roku papieski wizytator – delegat Stolicy Apostolskiej – biskup Jerzy Lascaris przeprowadził częściową reformę Akademii Zamojskiej, dzieląc ją na cztery wydziały i tak zwane klasy mniejsze. Reforma nieco dźwignęła uczelnię, ale nie na długo. Wskutek opłakanego stanu Akademii w XVIII wieku zaniedbany gmach po reformie biskupa Jerzego Lascarisa został ukończony i zmodernizowany w latach 1752 – 65 przez architektów zamojskich Andrzeja Bema i J. de Kawe. W 1772 roku Zamość został włączony do zaboru austriackiego. Mimo braku formalnego aktu rozwiązania Akademii, 19 lipca 1784 roku odbyło się ostatnie zgromadzenie zarządu uczelni, na którym postanowiono rozwiązać wspólny stół dla profesorów pozostających w Akademii. Po 190 latach funkcjonowania Akademia Zamojska została zamknięta przez władze austriackie. Tradycje oświatowe Zamościa kontynuowało powołane przez ordynata Stanisława Kostkę Zamoyskiego Liceum Królewskie, przekształcone przełomie XVIII i XIX wieku w Szkołę Wojewódzką imienia Zamoyskich. Pod światłym patronatem ordynatów: Andrzeja, kanclerza wielkiego koronnego oraz Stanisława Kostki Zamoyskich szkoła osiągnęła bardzo wysoki poziom. Miała laboratorium fizyczne, gabinet mineralogiczny zorganizowany staraniem Stanisława Staszica i salę rysunkową (zajęcia prowadził Benedykt Ittar). Na zakończenie roku szkolnego ogłaszano konkursy.

Od 1916 roku w gmachu dawnej Akademii Zamojskiej – w wielkim piętrowym czworoboku na rogu ul. Akademickiej i ul. Pereca – mieści się I Liceum Ogólnokształcące imienia Jana Zamoyskiego.

Uczelnia rozpoczęła działalność wykładami dla studentów zgrupowanych w pięciu nacjach: polskiej, litewskiej, ruskiej, prusko – inflanckiej i cudzoziemskiej (obejmującej wszystkich innych cudzoziemców). Od 1637 roku uczelnia miała prawo nadawania stopni doktora filozofii, od 1648 roku – teologii. Mimo, że uczelnia korzystając z praw uniwersyteckich, zaczęła nadawać doktoraty z prawa, nie podniosło to jej prestiżu. Trwałym dorobkiem Akademii Zamojskiej było wykształcenie wielu humanistów, biskupów, senatorów, ministrów, kasztelanów, którzy wnieśli znaczny wkład w rozwój kultury, nauki i reformy w Rzeczypospolitej. Jednak jako absolwenci opuszczali jej mury przede wszystkim prawnicy – notariusze. Kwitły jedynie popisy oratorskie oraz teatr akademicki. Pisanie panegiryków na cześć Zamojskich i innych możnych stało się głównym i ulubionym, bo intratnym zajęciem wielu profesorów.

Wydawnictwa z drukarni akademickiej osiągnęły wysoki poziom edytorski. Z kierowanej przez Marcina Łęskiego oficyny zamojskiej wychodziły druki łacińskie, greckie, podręczniki akademickie, prace filozoficzne, prawnicze, medyczne i utwory poetyckie.

Kanclerz zamierzał uczynić z Akademii prężny ośrodek kultury polskiej i katolickiej, który oddziaływałby silnie na ludność prawosławną, przeważającą w województwach południowo ­ wschodnich. Program nauczania Akademii został jednak po śmierci założyciela w 1605 roku zniekształcony. Akademia stała się wtedy typową szkołą średniowieczną, zwłaszcza po utworzeniu w połowie XVII wieku katedry teologii, kiedy zaczęto kształcić przede wszystkim księży (1648 rok). Do chwili śmierci hetmana, w ciągu pierwszych jedenastu lat swego istnienia, Akademia zdobyła sobie znaczny rozgłos nie tylko w Polsce, ale także w całej Europie. Dzięki niej Zamość na przełomie XVI i XVII wieku był najbardziej prężnym ośrodkiem myśli naukowej w Polsce. Akademia w okresie dwuwiekowego istnienia przeżywała swoje upadki i wzloty. Okres świetności Akademii to lata 1595-1648. Do świetniejszych lat Akademii przypadających na życie jej fundatora nawiązywał później Stanisław Konarski i Szkoła Rycerska.

Językami wykładowymi była łacina i greka. Język polski odgrywał niewielką rolę w Akademii Zamojskiej. Tendencja do ograniczania języka polskiego wynikała z przekonania, że łacina jest jedynym językiem godnym używania przy omawianiu spraw naukowych. W niższych klasach nauczano ortografii polskiej w opracowaniu Kochanowskiego, tłumaczono teksty z polskiego na łacinę i grekę, w starszych klasach natomiast wprowadzono przekłady „tekstów retorycznych” z polskiego na łacinę.

Cały kurs nauki trwał 11 lat, to jest od siódmego do osiemnastego roku życia. Początkowo przeznaczona dla szlachty; po reorganizacji jednak udział dzieci szlacheckich wynosił tylko 20 %, a z czasem spadł do 10 %. Liczba uczniów w ciągu pierwszych czterdziestu lat wynosiła 2745, czyli średnio kształcono siedemdziesięciu uczniów rocznie.

Na uwagę zasługuje jej pierwotna organizacja. Na czele Akademii stał rektor, dziekan, kwestor i czterech radnych. Po oficjalnym powstaniu Akademii Zamojskiej jej pierwszym rektorem został lwowianin Melchior Stephanides, pełniący tę funkcję w latach 1595 – 1597. Władze były wybierane przez profesorów i pięciu przedstawicieli młodzieży (nacji polskiej, litewskiej, ruskiej, prusko – inflanckiej i cudzoziemskiej). Był to pierwszy przypadek udziału młodzieży w zarządzie uczelni od czasów Kazimierza Wielkiego. Nadzór nad Akademią zgodnie z wolą papieża sprawował biskup chełmski jako kanclerz Akademii Zamojskiej, ale bez większych prerogatyw.

Zgodnie z przywilejem papieża Klemensa VIII, wydanym 29 grudnia 1594 roku, Akademia Zamojska miała trzy wydziały: wstępny (artes), przygotowujący do właściwych studiów oraz prawa i medycyny. Studia były dwustopniowe: stopień niższy wstępny (classes inferiores) i normalny wyższy (classes superiores). Główny nacisk położony został na obywatelską i narodową stronę wychowania. Pod względem organizacyjnym szkoła dzieliła się na:
Roczny kurs elementarny, gdzie nauka rozpoczynała się od pisania i czytania w języku polskim według ortografii Jana Kochanowskiego
Stopień średni – czteroklasowy (6-letni)
Stopień akademicki – dwuletni. Realizowano tu program dawnego trivium i quadrivium oraz metafizykę, fizykę, etykę, ekonomię i politykę. Wykształcenie zamykała wiedza prawnicza (prawo rzymskie, magdeburskie, saskie, polskie wraz z historią ustroju Polski).

Zorganizowanie Akademii przewidywał Jan Zamoyski od razu w zakładanym mieście Zamościu. Już w 1581 roku istniała szkoła kierowana przez zdolnego filozofa księdza Jana Herbesta, przekształcona jednak w 1584 roku w szkołę parafialną przy kościele świętego Krzyża na Przedmieściu Lwowskim. Dopiero w 1589 roku powstała bardziej ambitna szkoła średnia – gimnazjum kierowane przez trzy lata przez łacińsko – polskiego poetę Sebastiana Klonowicza (Acernusa) z Lublina.

W utworzeniu uczelni pomogli hetmanowi dwaj wybitni poeci: Sebastian Klonowic i Szymon Szymonowic. Głównym doradcą Zamoyskiego i współorganizatorem Akademii był znakomity poeta nadworny Szymon Szymonowicz (Szymon Bedoński ze Lwowa, znany wówczas jako Simon Simonides). Zwerbował on z Krakowa trzech pierwszych profesorów, dbając o dobór ludzi rzeczywiście wybitnych i przyczynił się do uruchomienia w 1594 drukarni. Udzielał także wskazówek przy układaniu programów naukowych i tworzeniu podstaw organizacyjnych Akademii.
Publiczne ogłoszenie powstania Akademii wydał Zamoyski 5 kwietnia 1594 roku, w czasie kryzysu Akademii Krakowskiej i narastającego wpływu jezuitów na szkolnictwo. Założenie Akademii Zamojskiej było jednym z najbardziej znaczących wydarzeń w życiu kulturalno – oświatowym na polsko – ukraińskim pograniczu etnicznym w drugiej połowie wieku XVI i w pierwszej połowie XVII. Okres ten charakteryzuje pojawienie się oraz rozwój nowych zjawisk w szkolnictwie. Powstają i rozwijają się nowe szkoły średnie, kształtują się warunki do tworzenia instytucji oświatowych na poziomie wyższym. Przygotowania do otwarcia Akademii w nowo założonym Zamościu trwały prawie dwa dziesięciolecia.

W związku z otwarciem Akademii powstały pierwsze budowle z audytoriami oraz domy dla profesorów i studentów (bursa), projektowane przez B. Moranda i usytuowane w północno – zachodnim rejonie miasta.

Kilka miesięcy po publicznym ogłoszeniu powstania Akademii papież Klemens VIII zatwierdzając bullę powołania uczelni przydał swój herb rodowy Aldobrandinich do godła Akademii. Uroczystości otwarcia uczelni odbyły się 15 marca 1595 roku. Kanclerz uczynił z akademickiej uroczystości wydarzenie o randze historycznej. Oto trzecia po Uniwersytecie Jagiellońskim i Wileńskim, ale pierwsza kształcąca w obywatelskim duchu uczelnia rozpoczęła pracę. Z okazji uroczystego otwarcia uczelni Zamoyski wydał „Odezwę do Polaków”, w której przedstawił cele Akademii Zamojski pisał: „Bez nauk bowiem, acz mogą być niektórzy cnotliwi i światli, gdy lud w ciemności, walą się królestwa, upadają mocarstwa same dostojeństwa ciężarem się stają.”