Akademia Zamojska w intencji fundatora miała być szkołą obywatelską przeznaczoną dla młodzieży szlacheckiej przygotowującej się do służby państwowej. Początkowo Akademia przeznaczona była wyłącznie dla młodzieży szlacheckiej i katolickiej i miała uczyć studentów myślenia kategoriami obywatelskimi i przygotować ich do służby publicznej. Jak pojmował wielki hetman cel wychowania, mówi o tym fragment dyplomu fundacyjnego z 5 lipca 1600 roku: „Zawsze takie Rzeczpospolite będą” – pisze – „jakie ich młodzieży chowanie. Nadto przekonany jestem, że tylko edukacja publiczna zgodnych i dobrych robi obywatelów. Przeto chętnie poświęcam cząstkę majątku na ustanowienie w Zamościu Akademii, w ktorejby polska młodzież brała zdrowe obyczajów początki i ćwiczyła się w naukach dążących do jednego z ustawami Rzeczpospolitej zamiaru.”

Osobny rozdział w dziejach oświaty polskiej końca XVI-XVII wieku zajmuje Akademia Zamojska. Jej fundator, Jan Zamoyski (1542-1605), hetman wielki koronny i kanclerz, wykształcony we Włoszech i w Paryżu, były rektor uniwersytetu w Padwie, należał do najwybitniejszych mężów w Polsce. Miał duże zrozumienie dla doniosłej roli wychowania w życiu publicznym. Działając w tym duchu usiłował początkowo zreformować Uniwersytet Krakowski. Skoro plany te okazały się nierealne, powziął zamiar ufundowania własnej szkoły. Zgodnie z jego intencjami miała być półwyższą uczelnią humanistyczną o charakterze świeckim, mającą kształcić światłych obywateli państwa, zdolnych do wypełniania obowiązków w służbie publicznej.

Zorganizowanie Akademii przewidywał Jan Zamoyski od razu w zakładanym mieście Zamościu. Już w 1581 roku istniała szkoła kierowana przez zdolnego filozofa księdza Jana Herbesta, przekształcona jednak w 1584 roku w szkołę parafialną przy kościele świętego Krzyża na Przedmieściu Lwowskim. Dopiero w 1589 roku powstała bardziej ambitna szkoła średnia – gimnazjum kierowane przez trzy lata przez łacińsko – polskiego poetę Sebastiana Klonowicza (Acernusa) z Lublina.

W utworzeniu uczelni pomogli hetmanowi dwaj wybitni poeci: Sebastian Klonowic i Szymon Szymonowic. Głównym doradcą Zamoyskiego i współorganizatorem Akademii był znakomity poeta nadworny Szymon Szymonowicz (Szymon Bedoński ze Lwowa, znany wówczas jako Simon Simonides). Zwerbował on z Krakowa trzech pierwszych profesorów, dbając o dobór ludzi rzeczywiście wybitnych i przyczynił się do uruchomienia w 1594 drukarni. Udzielał także wskazówek przy układaniu programów naukowych i tworzeniu podstaw organizacyjnych Akademii.
Publiczne ogłoszenie powstania Akademii wydał Zamoyski 5 kwietnia 1594 roku, w czasie kryzysu Akademii Krakowskiej i narastającego wpływu jezuitów na szkolnictwo. Założenie Akademii Zamojskiej było jednym z najbardziej znaczących wydarzeń w życiu kulturalno – oświatowym na polsko – ukraińskim pograniczu etnicznym w drugiej połowie wieku XVI i w pierwszej połowie XVII. Okres ten charakteryzuje pojawienie się oraz rozwój nowych zjawisk w szkolnictwie. Powstają i rozwijają się nowe szkoły średnie, kształtują się warunki do tworzenia instytucji oświatowych na poziomie wyższym. Przygotowania do otwarcia Akademii w nowo założonym Zamościu trwały prawie dwa dziesięciolecia.

W związku z otwarciem Akademii powstały pierwsze budowle z audytoriami oraz domy dla profesorów i studentów (bursa), projektowane przez B. Moranda i usytuowane w północno – zachodnim rejonie miasta.

Kilka miesięcy po publicznym ogłoszeniu powstania Akademii papież Klemens VIII zatwierdzając bullę powołania uczelni przydał swój herb rodowy Aldobrandinich do godła Akademii. Uroczystości otwarcia uczelni odbyły się 15 marca 1595 roku. Kanclerz uczynił z akademickiej uroczystości wydarzenie o randze historycznej. Oto trzecia po Uniwersytecie Jagiellońskim i Wileńskim, ale pierwsza kształcąca w obywatelskim duchu uczelnia rozpoczęła pracę. Z okazji uroczystego otwarcia uczelni Zamoyski wydał „Odezwę do Polaków”, w której przedstawił cele Akademii Zamojski pisał: „Bez nauk bowiem, acz mogą być niektórzy cnotliwi i światli, gdy lud w ciemności, walą się królestwa, upadają mocarstwa same dostojeństwa ciężarem się stają.”